在现代生物技术领域，蛋白质表达载体是研究和生产蛋白质的重要工具。它们使得研究人员能够在实验室条件下高效地生产和研究蛋白质，这对于药物开发、疫苗生产以及基础科学研究至关重要。
本文将探讨蛋白质表达载体的设计与应用，以及原核生物和真核生物在蛋白质表达方面的生理差异如何决定所使用的分子组件。
01 蛋白质表达载体概述
1.1 蛋白质表达载体的原理
蛋白质表达载体的核心任务是将目标蛋白质的基因模板克隆到质粒或其他载体中，使得这些模板能够转录成mRNA，并最终翻译成蛋白质。这一过程涉及到复杂的分子生物学操作，包括DNA克隆、转录和翻译控制。
1.2 蛋白质表达载体的目的
进行蛋白质表达载体的精细设计和操作主要基于两个核心目的：生产制造和体内使用。
生产制造涉及研究用的酶、商业化的治疗性蛋白质（如抗体、胰岛素、疫苗等）的生产，这些蛋白质在纯度上要求极高，因为它们可能用于蛋白质测序、晶体学研究或冷冻电镜等，这些研究领域需要高纯度和结构稳定的蛋白质样本。
而体内使用则包括将基因在细胞内表达作为基因治疗的一部分，或者为了理解蛋白质的功能而使用报告系统、显微镜观察以及追踪目标蛋白质。
02 蛋白质表达系统生理差异
蛋白质表达系统主要分为两大类：原核生物和真核生物。
2.1 细胞结构
原核生物
细菌作为典型的原核生物，具有双层膜结构，其内外膜之间的区域被称为周质空间。由于缺乏细胞器，细菌的核糖体在转录过程中同步进行蛋白质合成，使得蛋白质的合成和分泌成为一个连续的过程。
在细菌中，新合成的蛋白质有多种去向：胞质蛋白留在细胞质中执行功能；分泌蛋白通过特定途径被运输到细胞外；周质蛋白定位到周质空间参与物质转运或作为酶发挥作用；膜蛋白则嵌入到细胞的内膜或外膜中，参与物质转运或信号传递。
真核生物
真核生物拥有复杂的细胞结构和区室结构。RNA在细胞核中合成后，被转运至细胞质进行翻译。此外，真核生物还具有内质网、高尔基体等细胞器，这些细胞器负责蛋白质的修饰、加工和分泌。
2.2 蛋白质运输和修饰
原核生物
细菌的蛋白质运输相对简单，主要发生在细胞质和周质空间之间。由于缺乏细胞器，细菌的蛋白质修饰类型有限，主要是糖基化和脂多糖修饰。这些脂多糖是细菌细胞壁的组成部分，具有免疫原性，可能引发宿主的免疫反应。
因此，在生物制药领域，确保治疗性蛋白质的纯度，避免脂多糖等污染物的存在，对于保障药物的安全性和有效性至关重要。
真核生物
真核生物的蛋白质运输系统复杂且高效。其细胞质中的内质网等细胞器不仅负责合成和加工蛋白质，还确保蛋白质能够被精确地运输到细胞内的特定位置，如囊泡、线粒体、细胞膜，或者分泌到细胞外。
此外，真核生物还拥有复杂的翻译后修饰系统，包括糖基化、磷酸化、乙酰化等，这些修饰对于蛋白质的功能和稳定性至关重要。
2.3 蛋白质大小和复杂性
原核生物
细菌作为原核生物，其细胞结构相对简单，仅由一个细胞膜包围细胞质，缺乏膜结构的细胞器。这种简单的细胞结构导致细菌中的蛋白质合成后通常直接在细胞质中折叠并发挥作用，或通过简单的分泌系统被运输到细胞外。与真核生物相比，细菌缺乏复杂的蛋白质转运和修饰系统。
此外，细菌细胞质的还原性环境不利于二硫键的形成，而适合形成二硫键的氧化性环境仅限于周质空间。因此，细菌在处理需要复杂折叠和翻译后修饰的大型或复杂蛋白质时可能会遇到困难。
真核生物
真核生物的蛋白质通常体积大且结构复杂，因此在细胞内折叠与转运过程中面临更多挑战，尤其是分子量超过100kDa的蛋白质。其庞大的分子结构和复杂的细胞器系统增加了转运及正确折叠的难度。
然而，真核生物也具备独特的优势，如丰富的二硫键和其他翻译后修饰，这些特性使得真核生物在表达大型或复杂蛋白质方面表现出色。
2.4 异源表达
原核生物
原核生物，特别是细菌，尽管在表达大型或复杂蛋白质时存在局限性，但仍是异源表达的重要平台。这得益于细菌系统生长快速、成本低廉、操作简便等优点。
通过优化策略，如调整密码子以适应细菌偏好、添加分泌标签促进蛋白质分泌、改变蛋白质定位以提高其在细菌中的可溶性和稳定性，可以在细菌中成功表达多种外源蛋白质。
真核生物
真核生物系统，尤其是哺乳动物细胞系统，因其能够模拟人体内的蛋白质表达和修饰环境，而异源表达能力更强。这对于生产需要精确折叠和复杂翻译后修饰的治疗性蛋白质尤为重要。因此，哺乳动物细胞系统成为生产这类蛋白质的理想选择。
然而，与原核生物系统相比，真核生物系统的成本较高，操作更复杂，需要更多的时间和资源投入，包括细胞培养条件的优化、生物反应器的运行以及后续的蛋白质纯化等步骤。
03 蛋白质表达载体的设计
3.1 选择模板DNA
在制备模板DNA时，基因克隆和基因优化是两个核心步骤。
基因克隆是将目标基因（即编码我们希望在宿主细胞中表达的蛋白质的序列）插入载体（如质粒或病毒载体）中的过程。这一过程通常通过PCR扩增来复制目标基因，或使用限制性内切酶和连接酶通过酶切连接的方法实现，也可以通过同源重组技术来完成。
基因克隆后，为了提高目标基因在异源宿主中的表达效率，有时需要进行基因优化。这可能包括调整基因中的密码子使用频率以匹配宿主细胞的偏好，去除内含子以避免宿主细胞处理上的困难，或添加适当的调控序列如启动子和终止子，以确保基因在宿主细胞中得到正确的调控和表达。
3.2 选择载体
选择合适的载体对基因克隆实验至关重要，因为它直接影响目标基因的表达效率和稳定性。载体的选择需要基于以下几个标准。
类型：根据实验需求选择不同类型的载体，如质粒、病毒载体或人工染色体。每种载体有其特定优势和局限性，如质粒常用于原核生物，病毒载体更适合真核生物。
大小：载体大小需适中，既要足够大以容纳目标基因和必要的调控序列（如启动子、终止子等），又要避免过大，因为过大的载体可能导致在宿主细胞中的不稳定性和复制困难。
稳定性：载体必须足够稳定，以确保它能够在宿主细胞中稳定复制和表达目标基因。稳定性差的载体可能导致表达效率低下或实验结果不一致。
拷贝数：载体的拷贝数指的是每个宿主细胞中载体的副本数量。高拷贝数的载体可以提高目标蛋白质的表达水平，因为它们提供了更多的模板供转录和翻译。但高拷贝数也可能增加细胞的代谢负担，导致细胞生长缓慢或稳定性下降。
3.3 添加调控序列
启动子
启动子是DNA序列的一部分，位于目标基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的位点。
启动子的主要功能是启动转录过程，即促使RNA聚合酶结合并开始合成mRNA。选择合适的启动子对于确保目标基因在宿主细胞中得到高效表达至关重要。不同的启动子具有不同的强度和特异性，适合不同的实验需求和宿主细胞类型。
终止子
终止子是转录的终止信号，指示RNA聚合酶停止转录并释放新合成的mRNA。
终止子的作用不仅是结束转录，还能防止转录过程中的读码框移位（即mRNA序列的错误解读）和转录本的不稳定降解。有效的终止子可以确保生成的mRNA是完整的，并且在细胞内稳定存在，从而提高蛋白质的表达效率。
增强子和沉默子
增强子是可以增强启动子活性的调控元件，通常位于启动子的上游或下游。增强子的存在可以提高目标基因的转录水平，从而增加蛋白质的表达量。
沉默子则是抑制启动子活性的调控元件，能够降低目标基因的表达水平。沉默子的作用可以帮助调节基因表达，以适应细胞的需求或特定的实验条件。
3.4 设计标签和融合蛋白
纯化标签
纯化标签是为了简化和加速蛋白质纯化过程而设计的一段肽序列，可以添加到目标蛋白质的N端或C端。
常见的纯化标签包括His标签（含有多个组氨酸残基）和GST标签（谷胱甘肽S转移酶）。这些标签使得目标蛋白质能够特异性地结合到相应的亲和树脂上，如镍或钴树脂对于His标签，谷胱甘肽树脂对于GST标签。通过这种方式，可以轻松地从细胞裂解液中分离和纯化目标蛋白质。
分泌标签
分泌物标签，也称为分泌信号肽，是一段特殊的氨基酸序列，能够指导蛋白质通过细胞膜分泌到细胞外。
如果目标蛋白质需要在细胞外发挥作用或进行进一步的研究，如在生物制药中，可以添加分泌物标签以确保蛋白质能够正确地被转运和分泌。
融合蛋白
融合蛋白是将目标蛋白质与其他蛋白质或肽序列融合在一起表达，以形成一个新的、具有特定功能的蛋白质。
这种设计可以用于多种目的，例如：荧光蛋白融合：将目标蛋白质与绿色荧光蛋白（GFP）或其他荧光蛋白融合，可以在显微镜下直接观察蛋白质的表达、定位和动态变化，这对于细胞生物学研究非常有用。
3.5 考虑宿主细胞及其特性
在选择宿主细胞进行蛋白质表达时，必须综合考虑宿主细胞的特性，因为这些特性直接影响蛋白质的表达、修饰和最终的功能。以下是针对不同宿主系统的考量：
原核生物（细菌）：细菌的双层膜结构和周质空间对其蛋白质表达和修饰有重要影响。由于缺乏细胞器，细菌可能无法进行复杂的翻译后修饰，这可能限制了某些蛋白质的功能。
真核生物：真核生物的复杂细胞结构和生理分隔对蛋白质的运输、修饰和降解起着关键作用。特别是，不同真核生物在糖基化等翻译后修饰方面的差异，可能会显著影响蛋白质的功能和活性。
特定宿主系统：对于特定的宿主系统，如昆虫细胞，其培养条件（如27摄氏度的培养温度）与酵母和哺乳动物细胞（通常在37摄氏度下培养）不同，这可能会影响蛋白质的修饰模式。虽然这种温度差异可能对某些需要复杂折叠的蛋白质有益，但也可能引起异源蛋白质的毒性反应，需要特别关注。
此外，植物细胞虽然在蛋白质表达中的使用较少且产量一般较低，但在特定情况下仍具有独特的应用价值。无细胞翻译系统虽然成本较高且产量有限，但在需要快速获得蛋白质时提供了一个有用的选择。
3.6 优化表达条件
培养条件
不同的宿主细胞对生长和表达蛋白质的条件有不同的要求。这些条件包括温度、pH值、营养成分、氧气供应等。
温度：不同的宿主细胞有其最适生长和表达温度。例如，细菌通常在37°C下生长，而酵母可能在30°C下生长。
pH值：细胞培养的pH值需要维持在一定范围内，以保证宿主细胞的生长和代谢活动。
营养成分：宿主细胞需要适当的营养物质来支持生长和蛋白质合成，这可能包括碳源、氮源、维生素和微量元素。
通过优化这些培养条件，可以提高目标蛋白质的表达水平和稳定性，从而获得更多的功能性蛋白质。
诱导表达
某些蛋白质表达载体系统是诱导型的，意味着它们在添加特定诱导剂之前不会或很少表达目标基因。
诱导剂：诱导剂是一种小分子或环境信号，能够激活特定的调控元件，从而启动或增强目标基因的表达。例如，在乳糖操纵子系统中，乳糖作为一种诱导剂，能够诱导大肠杆菌中β-半乳糖苷酶的表达。
通过控制诱导剂的添加，可以精确控制目标蛋白质的表达时间，这有助于避免宿主细胞因长时间表达异源蛋白质而产生的负担，同时可以在最佳的生长阶段快速诱导蛋白质的表达。
04 蛋白质的表征和分析
4.1 蛋白质表征
蛋白质表征是指确定蛋白质的物理和化学特性，包括其分子量、纯度、结构、修饰状态等。这可以通过多种实验技术来完成。
SDS-PAGE：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来评估蛋白质的分子量和纯度。
Western blot：用于检测特定蛋白质的存在和大小，通过抗体特异性结合来检测。
质谱：用于确定蛋白质的精确分子量和鉴定蛋白质序列。
圆二色光谱（CD）和X射线晶体学：用于确定蛋白质的二级和三级结构。
4.2 蛋白质分析
蛋白质分析是指研究蛋白质的功能和活性，包括其与其他分子的相互作用、酶活性、结合特性等。这可以通过以下方法进行。
酶活性测定：对于酶类蛋白质，测定其催化反应的速率。
结合实验：如表面等离子共振（SPR）技术，用于研究蛋白质与其他分子的结合亲和力和动力学。
细胞实验：评估蛋白质在细胞内的功能和效应，如细胞毒性测试、信号传导分析等。