在科研的微观世界里，人肿瘤坏死因子 α（TNF - α）ELISA KIT 就像一位身怀绝技的 “浓度侦探”，专门用于破解人体生物液体中 TNF - α 的浓度密码。
一、基础档案
试剂盒有 96T 和 48T 两种规格，保质期 6 个月（具体看包装标签哦）。它就像一个专业的 “体外浓度检测仪”，能精准测量血清、血浆等生物液体里的 TNF - α 浓度，但记住，这可是科研专属 “神器”，临床诊断可不能用它。它的灵敏度高得惊人，能探测到低至 0.1pg/ml 的 TNF - α ，就像拥有一双超级 “火眼金睛”。而且特别 “专一”，只对 TNF - α 感兴趣，和其他类似物几乎不来往。重复性也很棒，不管在同一块板子上还是不同板子间检测，变异系数都小于 10% 。检测范围在 2.5pg/ml - 80pg/ml ，简直是 “本领高强”。
二、检测原理
它采用双抗体夹心法，这就像一场精心策划的 “分子抓捕大戏”。首先，把抗 TNF - α 抗体 “埋伏” 在酶标板上，就像在特定场地设下了天罗地网。实验一开始，样品或标准品中的 TNF - α 就像调皮的 “小目标”，会自动跳进 “陷阱” 与抗体结合。接着，加入辣根过氧化物酶标记的抗体，三者形成一个稳固的 “抓捕联盟”。反应结束后，通过洗板把那些游离的、没参与反应的 “小喽啰” 都清理掉。然后加入显色底物 TMB，在辣根过氧化物酶这位神奇 “魔法师” 的催化下，TMB 会从无色变成蓝色，再加终止液，瞬间变成黄色。神奇的是，颜色越深，说明样品中的 TNF - α 越多。最后，用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），就能算出样品中 TNF - α 的浓度啦。
三、实验必备物品
要使用这个试剂盒，还得准备好这些 “小帮手”：
- 酶标仪（450nm），它就像一个精准的 “数据读取器”，负责收集关键数据。
- 高精度加样器及枪头，像 0.5 - 10uL、2 - 20uL、20 - 200uL、200 - 1000uL ，它们是加样的 “得力助手”，能保证每一次加样都分毫不差。
- 37℃恒温箱，给实验提供一个温暖舒适的 “小窝”。
- 蒸馏水或去离子水，在实验中发挥着重要作用。
四、检测前准备
- 提前 “唤醒”：提前 1 小时把试剂盒和样本从冰箱拿出来，让它们在室温下好好 “适应适应”，准备迎接接下来的 “挑战”。
- 洗涤液准备：从冰箱拿出来的浓缩洗涤液要是有结晶，别担心，这是正常的。把它放在室温下，轻轻晃晃，等结晶化了再配洗涤液。比如，把 20ml 浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释成 400ml 能用的洗涤液，没用完的放回 4℃保存。20× 洗涤缓冲液按 1：20 用蒸馏水稀释，也就是 1 份 20× 洗涤缓冲液加 19 份蒸馏水。
五、样品收集方法
- 血清收集：全血样品在室温放 2 小时，或者在 4℃放一晚上，然后用 2000prm 的转速离心 20 分钟，取上层清液就能检测啦，装血的试管得是一次性没有内毒素的。
- 血浆收集：推荐用 EDTA 钠盐当抗凝剂，样品采好后 30 分钟内，用 2000prm 的转速离心 15 分钟，取上清液检测，千万别用溶血和高血脂的样品。
- 组织匀浆制备：用预冷的 PBS (0.01M，pH = 7.4) 把组织洗干净，去掉残留的血，称好重量后把组织剪碎。按照 1:9 的比例（比如 1g 组织就加 9mL PBS，这个比例可以根据实验情况调整，但要记好），把剪碎的组织和 PBS（最好加点蛋白酶抑制剂）放到玻璃匀浆器里，在冰上使劲磨。要是想让组织细胞碎得更彻底，还可以对匀浆液进行超声破碎或者反复冻融。最后用 5000prm 的转速离心 5 - 10 分钟，取上清液检测。
- 细胞提取液获取：贴壁细胞先用冷的 PBS 轻轻洗，再用胰蛋白酶消化，然后用 2000prm 的转速离心 5 分钟收集细胞；悬浮细胞直接离心收集就行。收集到的细胞用冷的 PBS 洗 3 次，每 1×106 个细胞加 150 - 200μL PBS 重新悬浮起来，通过反复冻融让细胞破碎（要是含量少，PBS 可以少加点）。把提取液用 2000prm 的转速离心 10 分钟，取上清液检测。
- 细胞培养上清或其他生物体液收集：用 2000prm 的转速离心 20 分钟，去掉杂质和细胞碎片，取上清液检测。
六、样品注意事项
- 保存技巧：样品要是 1 周内就检测，放在 4℃就行；要是不能马上测，就按每次用的量分开装，冻在 - 20℃以下，千万别反复冻融。还有，溶血的样品不能用来检测，结果会不准。
- 浓度处理：试剂盒能检测的浓度范围和样本实际的浓度范围可能不一样，要是样品里要检测的东西浓度比标准品最高值还高，就得根据实际情况稀释，最好先做个预实验，摸索出合适的稀释倍数。
- 其他要点：用化学裂解液做组织匀浆或细胞提取液，可能会因为加了化学物质，让 ELISA 测的值不准。还有，有些重组蛋白可能和试剂盒里的抗体不 “合拍”，就检测不出来。
七、操作步骤
- 确定板条数量：算算这次实验要用多少预包被板条，把要用的拿出来放在 96 孔框架里，剩下的放回铝箔袋封好，存到 4ºC。
- 充分平衡：试剂盒和样本在室温 (25 - 28ºC) 下待 1 小时，让它们充分达到室温，准备 “大展身手”。
- 设置孔位：把标准品孔、样本孔和空白孔设置好。
- 加样操作：标准品孔每个加不同浓度的标准品 50μL；样本孔加待测样本 50μL（要是需要可以先稀释）；空白孔加样本稀释液 50μL。
- 温育反应：所有孔里每孔加辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL，用封板膜把反应孔封得严严实实，放在 37℃水浴锅或恒温箱里温育 45min。
- 洗板环节：把液体倒掉，在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），等 20s，再把洗涤液甩出去，在吸水纸上拍干，这样重复洗 5 次，也可以用洗板机洗。
- 显色步骤：每孔加底物 A、B 各 50μL，在 37℃避光的地方放 15min，见证神奇的显色时刻。
- 终止与读数：每孔加终止液 50μL，15min 内，用酶标仪在 450nm 波长处测各孔的 OD 值。
八、结果计算
- 数据处理：标准品和样本要是设了复孔，就把它们的平均值算出来，这可是后续计算的重要依据。
- 绘制标准曲线：把标准品的浓度当成纵坐标，O.D. 值当成横坐标，精心画出标准曲线（怎么画最好，要看回归方程算出来的 R2 值，R2 越接近 1 越好）。
- 计算浓度：通过样品的吸光度值和标准曲线（可以用直线拟合或者 4 参数拟合），算出样品的浓度（工作人员能提供算浓度的软件）。要是样品之前稀释过，就得把算出来的浓度乘以稀释倍数，这才是样品真正的浓度。