基因组DNA提取的一般过程是将细胞在含有SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再经酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液 中析出。其中,SDS可破坏细胞膜、核膜、使得蛋白质与DNA分离,EDTA抑制细胞中DNA酶的 活性,蛋白酶K在SDS和EDTA存在下保持较好的活性、可将蛋白质降解为小肽或氨基酸,使得 DNA分子完整的分离出来。
方法与步骤(以人口腔黏膜上皮脱落细胞为材料举例)
(1)用清水漱口,使口腔清洁。
(2)用牙签伸入口腔内侧的颊部(位于上下牙齿之间的部位),由后向前分别在不同部 位刮取口腔黏膜上皮脱落细胞(可重复2~3次),刮取物悬浮于1ml生理盐水中,2000rpm离心 10分钟。
(3)弃上清,每管加1ml生理盐水重复洗涤一次,2000rpm离心10分钟。
(4)加入1ml细胞裂解缓冲液,转入另一1.5ml离心管中,加入蛋白酶K(500μg/ml)20μl, 混 匀。65℃水浴30分钟(或37℃水浴12~24小时),间歇震荡离心管数次。
(5)12000rpm 离心5分钟,上清液转移至另一离心管,加等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比 25:24:1),混匀,12000rpm离心5分钟。
(6)上清液转移至另一离心管,加等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1),混匀, 12000rpm 离心5分钟。
(7)上清液转移至另一管中,加入1/2体积的乙酸铵,加入2倍体积的预冷无水乙醇,混匀后 室温静置10分钟,12000rpm离心10分钟。
(8)弃上清,加入70%的乙醇洗涤,12000rpm离心15分钟,弃上清,沉淀自然干燥。
(9)提取的DNA晾干后,加入50μl TE缓冲液溶解基因组DNA,并于-20℃保存。